铁血短线:三角帆蚌寒凉药性与多糖效应相关性研究

Correlation Study on Cold Property of Hyriopsis Cumingii and Effect of Polysaccharides
陈文星[1]  吴  皓1  陆  茵1、2  李利斌3
CHEN Wenxing1  WU Hao1  LU Yin1，2   LI Libin3
南京中医药大学中医药研究院（中国  210029）1
Chinese Medicine Institute of Nanjing University of Chinese Medicine（China 210029）1
江苏省方剂研究重点实验室（中国  210046）2
Jiangsu Provincial Key Laboratory for Fangji Research（China 210046）2
徐州市中医院神经内科（中国 221000）3
Traditional Chinese Medical Hospital of Xuzhou（China 221000）3
中图分类号：R28  文献标识码：A   文章编号：1818－0086（2008）02
摘  要：目的  实验研究多糖效应，与三角帆蚌寒凉药性联系比较，分析二者的相关性。方法  以ADP和PAF为诱导剂，测定血小板最大聚集率；建立大鼠静脉注射内毒素（10u·kgP-1P）诱导的实热模型和附子、肉桂、干姜合剂灌服大鼠造成的虚热模型，分别观察多糖对血小板聚集和热证模型的影响。结果  多糖100mg·mlP-1P、50mg·mlP-1体外明显促进血小板聚集；静脉分别注射140mg·kgP-1P、70mg·kgP-1  30min后P对内毒素引起的温度升高有明显的降低作用（P< 0.05）；140mg·kgP-1P可明显降低虚热模型大鼠的血清T3值（P< 0.05）。结论  多糖表现明显的促凝集作用和解热作用，体现了寒凉的特性，三角帆蚌寒凉药性与多糖有明显的相关性，多糖是三角帆蚌寒凉药性的物质基础。
关键词：三角帆蚌；寒凉药性；多糖；促凝集作用；解热作用；药性物质基础
Abstract: Objective analyzing relationship between effect of polysaccharides from mussels and cold drug-property of mussels’ soft body. Methods  maximum agglutination induced by ADP and PAF was assayed；two types of rat heat-syndrome model induced respectively by injection of endotoxin or by administration of decoction composed of Fuzi, Rougui and Ganjiang were used. Results  polysaccharides from mussels should activate the platelet in vitro. Polysaccharides of 140 mg·kgP-1 and 70 mg·kgP-1 in vein indicate significantly antipyretic effect and heat syndrome due to insufficiency of Yin fluids in rats was disappeared through decreasing T3 level of serum. Conclusion  polysaccharides from mussels whose antipyretic effect and promotion of coagulation indicates cold property is the basic substance.
Key words: soft body of mussels; cold property; polysaccharides; antipyretic effect; promotion of coagulation; basic substance for drug-property
蚌科动物三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）用于培养珍珠的动物软体部分，即蚌肉，其性寒、味甘咸，入肝、肾二经。其入药在中医药理论文献中也早有记载。《日华子本草》：“蚌，明目，止消渴，除烦解热毒，补妇人虚劳、下血，并痔痿、血崩、带下”；《本草再新》：“治肝热，肾衰，托斑疹，解痘毒，清凉止渴”。
从三角帆蚌软体的水煎粗提物中经过多次分离初次得到一多糖，经分析为均质葡聚糖P，前期活性筛选中发现它能缩短小鼠凝血时间，但与钙离子、凝血酶等不相关。联系中医“热者寒之” 、“寒而凝滞”理论，三角帆蚌多糖缩短凝血时间、加速凝集，则可能是其寒凉药性的表现。为进一步确证这一想法，文中展开多糖对血小板聚集和热证动物模型的效应实验研究，求证多糖与三角帆蚌寒凉的相关性，对四性物质基础作尝试性研究。
1材料与方法
1.1动物  健康SD大鼠，雌雄各半，体重200-250g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。大耳白家兔，雌雄兼用，2.5~3.0kg，南京市青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2003-0027。
1.2 试剂  三角帆蚌多糖P[1]P（均质多糖，重均分子量约为140万，α-D-1，4 型葡聚糖，纯度>97%，由本研究院制剂室提供）；ADP（二磷酸腺苷），PAF（血小板活化因子），美国Biopool公司；六味地黄丸，宛西制药厂，批号：20061206；T3、T4 ELISA检测试剂盒（美国ENE公司）
1.3 仪器   Chronolog 540VS 血小板聚集仪（U.S.A），Physitemp BAT-12 测温仪（U.S.A），Spectra M199酶标仪（Molecular Devices, U.S.A）
2实验方法
2.1 血浆制备  家兔颈动脉取血，与抗凝剂（3.8%枸橼酸钠）9:1混匀，1000rpm离心8分钟，取得上层富血小板血浆（PRP），余血再以3500rpm离心10分钟，得贫血小板血浆（PPP）。
2.2 血小板聚集率的测定  以ADP和PAF分别为诱导剂诱导血小板聚集，按比浊法测定血小板聚集率。按2.1方法制备PPP和PRP，用PPP调整PRP中血小板数到约25万/ml，取350ml PRP置于比浊管内，然后加入多糖（终浓度分别为100、50、20mg·mlP-1），37℃温育5分钟，随后在PRP中加入7ml的ADP或PAF（终浓度为10μmol·L-1），在Chronolog 540VS血小板聚集仪上检测最大聚集率。
2.3 大鼠实热模型[2]  SD大鼠32只，雌雄各半，随机均分为4组，每组8只。分别为模型组、阿司匹林组（ig,30mg·kgP-1P）、多糖高剂量组（iv,100mg·kgP-1P）、低剂量组（iv,50mg·kgP-1P）。大鼠10%水合氯醛400mg·kgP-1P麻醉并固定，然后用肛温计实时连续观察其体温，待大鼠体温保持稳定后，尾静脉注射内毒素10u·kgP-1P，然后每隔10min记录一次体温数据，连续90min。多糖尾静脉给药干预在内毒素注射后30min，依前法记录体温数据。
2.4 大鼠虚热模型  参照文献方法[3]进行造模，连续14天,然后将造模大鼠分成5组，每组10只，在造模第10天后开始按多糖剂量干预给药（140mg·kgP-1P和70mg·kgP-1P，iv），每天给药一次，另设六味地黄对照组（81mg·kgP-1P，ig）。每天记录大鼠饮食饮水情况。给药7天后，眼眶后静脉丛采血，3000rpm、10min离心分离血清，用ELISA免疫试剂盒测定血清T3、T4水平。
2.5 统计方法
采用SPSS10.0 软件进行ONE-ANOVA 分析，结果用(`x±s) 表示。
3 结果
3.1 多糖对ADP、PAF诱导的血小板最大聚集率的影响
表1  多糖对ADP、PAF诱导的体外血小板最大聚集率的影响（`X±SD，n=6）
Table 1  effect of polysaccharides on rate of platelet maximum coagulation in vitro induced by ADP or PAF
（`X±SD，n=6）
组别
剂量(mg·mlP-1P)
最大聚集率（%）
ADP
PAF
对照组
--
39.00±4.00
50.62±6.50
阿司匹林
10
14.65±3.73**
36.51±4.68**
多糖
100
56.40±5.55**
66.34±7.27**
50
56.50±4.51**
60.82±5.96*
20
45.40±6.95
54.30±6.44
注：与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。Note: vs control, **P<0.01，*P<0.05
表1数据表明，多糖100mg·mlP-1P、50mg·mlP-1P作用下可明显增大ADP和PAF诱导的最大血小板聚集率，与对照组比较均呈现显著性差异（P<0.01和P<0.05），随着剂量减小，促凝聚作用减弱，量效关系明显。多糖促进凝血与促进血小板聚集密切相关。
3.2 多糖对实热证大鼠的解热作用
Figure 1  Effect of polysaccharides on hyperpyrexia induced by endotoxin in rats(n=8)
图1结果显示，大鼠尾静脉注射内毒素10u·kgP-1P后体温10min内先下降，然后再逐渐上升，至30min时与注射内毒素前比较出现明显差异，此后大鼠体温持续上升时间，1小时后基本平稳。多糖100mg·kgP-1P、50mg·kgP-1P注射给药在60min后出现明显的解热效应，此时大鼠体温与给药前比较有明显差异（P<0.05），多糖解热作用明显。
3.3 多糖对虚热证大鼠血清T3、T4的影响
图2：多糖对虚热证大鼠血清T3、T4的影响（n=10）。VS虚热组，*P<0.05；VS对照组，##P<0.01。
Figure 2  Effect of polysaccharides on T3、T4 of serum in rats withdeficiency heat syndrome. vs group of deficiency heat，*P<0.05, vs control，##P<0.01.
图2结果显示，大鼠连续灌胃给予附子、肉桂、干姜合剂（1:1:1）7天后，出现血清T3明显升高，符合文献报道的虚热证动物模型表现。多糖用药干预后，140mg·kgP-1P剂量下大鼠血清T3值出现下降，且与模型组比较有显著差异（P<0.05），70mg·kgP-1P大鼠血清T3值也表现下降，但无显著性差异。
4讨论
中药药性理论是中医药基础理论的一个组成部分，更是中药理论的核心基础，是指导临床中药应用必不可少的一部分[4、5]。四性即寒、凉、温、热，又是药性理论的重要组成，对其的现代研究众多学者也提出了自己的观点。余惠旻等[6]从生物动力学方面对生晒参和红参的药性进行了比较，认为中药的微量量热学可以作为量化四性的标准，从而阐明中药四性的科学性；盛良[7]将中药矿物药的四性研究与无机化学相结合，用酸碱性质来确定中药的寒凉温热；程彬彬[8]对中药四性的研究分为广义和狭义，认为寒凉药与温热药对机体产生的一切对立统一的作用均应属于四性的广义范畴，而对机体体温产生不同影响则应归属于四性的狭义范畴。侯家玉编[9]《中药药理学》中对于四性从影响中枢神经系统、内分泌系统、消化系统、基础代谢等方面做了较深入的概述，从多方面反应了四性的特性。
资料还显示，多数温热药尤其是活血化瘀药都对血液系统有明显的影响作用。因此本文首先从血液系统探讨评价四性的方法，以凝血时间、凝血酶时间、凝血活酶时间及血小板聚集等指标观察了多糖对血凝的影响，结果显示多糖明显促进血液的凝聚，其凝血机制与促进血小板凝聚有关，与其他指标如血浆复钙时间、凝血酶原时间、凝血活酶时间无明显相关性（这些凝血指标因未见明显影响，数据未列出）），这一结果恰好与温热药抑制血凝系统相反，从而反证三角帆蚌的寒凉药性，也符合中医“寒而凝滞”观点。其次，文中多糖对热证实验动物模型的影响作用也体现了中医临床应用三角帆蚌治疗热证的合理性。
综合以上认为，以三角帆蚌为例研究用血液系统血凝指标评价四性的方法具有可行性，三角帆蚌寒凉药性与多糖促凝聚作用和解热效应有明显的相关性，并据此明确了三角帆蚌寒凉药性的物质基础为多糖成分。
参考文献：
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[8]      Hou J Y. Pharmacology of traditional Chinese medicine. Chinese medicine Publishing House[M],2002:4
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