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PCR/RT-PCR疑难问题解答
Update:2009-01-05
From:绿谷生物网
Hot: 266
一、问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1.RNA被降解
建议解决方法:
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;
在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;
如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
2.RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法:
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3.多糖同RNA共沉淀
建议解决方法:
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4.用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法:
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5.起始RNA量不够
建议解决方法:
增加RNA量。
对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6.RNA模板二级结构太多
建议解决方法:
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
7.引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法:
在PCR前用RNaseH处理。
8.靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法:
尝试其他靶序列或组织
9.PCR没有起作用
建议解决方法:
对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
二、问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1.PCR引物设计较差
建议解决方法:
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
2.DNA含有抑制剂
建议解决方法:
诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。
3.富含GC的模板
建议解决方法:
对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
4.模板浓度太低
建议解决方法:
使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
5.镁离子浓度太低
建议解决方法:
从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6.退火温度太高
建议解决方法:
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7.引物浓度太低
建议解决方法:
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
相关参考 - Detecting DNA Contamination in RT-PCR
- Avoiding DNA Contamination in RT-PCR
- Gene-specific RT-PCR
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