西游记漂流开放时间:野山参微量DNA提取方法的研究

摘要　目的：为了从珍贵药材野山参的少量根须提取DNA，同时尽量保持野山参形态的完整，特研究本方法。方法：我们改进了CTAB提取法，设计了一种简捷的DNA制备方案。结果：从0.001g人参根须提取DNA，得率达2250μg/g。结论：RAPD扩增效果良好，可作其他药材微量组织提取DNA的参考方法。

The Extraction of DNA from Milligram Amounts of Wild Mountain Ginseng Tissues

Ma Xiaojun，Wang Xiaoquan,Cai Meilin,Sun Sansheng and Xiao Peigen
(Institute of Medicinal Plants, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100094)

　　Abstract　Objective:To keep wild mountain ginseng,a rare medicinal remedy,as intact as possible when extracting DNA from it,a new way to extract DNA has been explored.Method:The CTAB method was improved and a simple and direct way was developed. Result： From 0.001g of dried samples of ginseng root DNA was obtained in an amount up to 2.25μg.Conclusion:The RAPD fingerpringting generated by this DNA is as good as that by CTAB method.This new method may also be used for extraction of other precious Chinese medicinal materials.
　　Key words　wild mountain ginseng;DNA;extraction method

　　提取DNA是分子生物学研究工作的第一步，DNA质量的好坏关系到后继工作的成功与否。好的DNA提取方法应该是DNA分子较完整，降解较少，蛋白质、多糖、多酚等杂质去除较彻底，同时具有较高得率的方法。DNA提取方法繁多^［1］，因工作目的而异，就植物材料来说，目前较为通用的方法是CTAB法^［2］，其主要原理是：CTAB(cetyltriethylammonium bromide)与DNA形成的复合物溶解于高盐溶液中，转至低盐溶液时沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离^［3］。该方法提取的DNA纯度较高，但步骤较多，得率不高，不适于微量DNA的提取。
　　野山参是价格十分昂贵的珍稀药材。为研究野山参的遗传多样性和进行DNA指纹鉴定，有必要研究微量材料的DNA提取方法，以便从少量根须提取DNA而不破坏野山参的整体形态。为此，我们改进了CTAB提取法，设计了一种简捷的DNA制备方案，在得率和PCR扩增效果方面与经典CTAB法进行了比较。

1　材料与方法
1.1　实验材料
　　栽培人参Panax ginseng C. A. Mey.采自吉林省吉安市国营一参场，由徐昭玺研究员鉴定；3个野山参标本参龄为40～50年，分别来自吉林省延边市、集安市和抚松县，由孙三省教授鉴定。本实验用栽培参的材料比较DNA提取方法和随机扩增多态DNA(RAPD)实验的效果，然后用效果最好的方法提取3个野山参样品加以验证。
1.2　DNA提取方法
　　我们比较了3种DNA提取方法，材料均用同一5年生栽培人参干燥参须，方法1是经典的CTAB法。方法2是简化的CTAB法。方法3仅经CTAB液提取和氯仿抽提两步，上清液直接过Wizard纯化系统(Wizard^TMclean-up system,Promega公司生产)，详细步骤如下。
1.2.1　方法1　CTAB法:0.2g干燥根须，加2×CTAB缓冲液10ml研磨，置65℃的水浴振荡30min，用等体积氯仿异戊醇(体积比24∶1)抽提，11000r/min离心30s，上清加入1/10体积10%CTAB混匀，加等体积氯仿异戊醇混匀，11000r/min离心30s，取上清加等体积CTAB沉淀液混匀,离心11000r/min 10min，沉淀溶于2ml高盐TE溶液，加等体积预冷100%乙醇，8100r/min离心10min，2倍体积80%乙醇洗2遍，室温下干燥20min，溶于200μl 0.1×TE。
1.2.2　方法2　0.2g干燥根须，加2×CTAB提取液10ml研磨，置65℃水浴振荡30min，等体积氯仿抽提，11000r/min离心30s，上清加入1/10体积3mol/L NaAc，加等体积预冷的异丙醇，-30℃3min，8100r/min离心15min，80%乙醇洗涤，溶于200μl 0.1×TE。
1.2.3　方法3　称0.001g干燥根须，在小研钵中研磨后加2×CTAB缓冲液0.5ml，用剪去尖端的Tip收集于1.5ml Eppendorff管，置65℃水浴振荡30min，用0.5ml氯仿抽提，11000r/min离心30min，取上清作Wizard纯化，溶于50μl0.1×TE。
1.3　DNA浓度检测
　　每个样品均用紫外分光光度仪(Beckman DU 650型)和电泳(含0.5μg/ml EB的0.8%Agrose胶，电极液用1×TAE)2种方法同时测定DNA浓度，由浓度算出DNA得率。
1.4　RAPD扩增
　　DNA扩增在Idahol 605型毛细管气浴式PCR仪上进行^［4］，反应体系为10μl,成分为：模板1ng/μl,引物1μmol/L,dNTP各200μmol/L，Ficoll 1%,酒石黄1mmol/L。RAPD扩增条件：94℃1min，35℃10s，72℃1min。此程序二循环后接第2个程序45个循环：94℃2s，35℃10s，72℃1min，最后72℃保温4min。PCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)上电泳，电泳结果在透射式紫外灯上观察并用FOTODYNE型紫外自动成像仪照相。引物使用美国Operon Technologies公司生产的OPY-04和OPF-02。碱基序列分别为：OPY-04：5＇-CAGAAGCGGA-3＇和OPF-02：5＇-GAGGATCCCT-3＇。

图1　山参DNA的提取
1.λDNA 40ng　2.λDNA 400ng　3～5.山参样品

2.2　RAPD扩增效果比较
　　OPY-04和OPF-02两个引物的扩增指纹来看，方法1(CTAB法)和方法3获得了完全一样的图型，OPY-04得到5条强带，OPF-02得到6条强带。我们还比较了用方法3提取的栽培参根和叶的DNA所做的RAPD指纹，结果完全一致(图2)。我们用方法2的DNA提取液的各级稀释液(原液及45，5，2.5ng/μl)做RAPD扩增，结果不够稳定，有的未扩增出条带，有的条带不一致。尽管紫外仪比色法未检测出DNA质量问题，但PCR实验说明方法2提取的DNA纯度不高。

图2　不同方法提取DNA所作的RAPD扩增
M.Marker
左：引物OPF-02　1.方法3(根)　2.方法3(叶)
右：引物OPY-04　3.方法3　4.方法1

3　讨论
3.1　用方法2即简易CTAB法提取的DNA原溶液较为粘稠，说明溶液中仍含有多糖等杂质，用该法提取原液做PCR扩增效果不好。因此，这种方法不适合用于从微量材料中提取DNA。用方法1(CTAB法)提取DNA，虽然DNA质量较好，RAPD指纹也很稳定，但得率太低，过多的操作步骤丢失了许多DNA，我们从DNA沉淀后弃去的上清中，用异丙醇重新回收DNA，经电泳检测证明仍含有DNA，因此，本方法同样不适于作微量珍稀材料的DNA提取。
3.2　用方法3提取DNA具有很高的得率，用比色法和电泳法检测得率约为2250μg/g，比方法2和方法1分别高4倍和5114倍，并超过许多种提取方法的DNA得率。我们的方法仅保留了CTAB法十几个步骤中的2个关键步骤，略去其他步骤，因此得到的DNA较完整，分子长度比λDNA分子量(48kb)略小。本实验用方法3提取微量野山参DNA得率不似栽培参DNA那么高，原因是野山参采集过程复杂、保存困难致使样品本身DNA降解较多所造成的。实验证明本方法提取的DNA用于RAPD分析，可以获得满意的效果。应用毛细管PCR方法^［5］)扩增RAPD指纹，每次实验(模板1.25ng)比用Eppendorff管节省DNA模板几十倍，仅用0.001g的植物材料即可进行2000多次PCR反应。显然，这种方法是提取珍稀药材微量DNA的有效方法。我们试用这种方法提取10个野山参材料(0.05～0.3g)的DNA，现已全部获得了成功。