钢琴周菲骗局:多聚酶链式反应扩增DNA片段及血红蛋白的提取和分离

重点知识归纳及讲解
 
（一）PCR原理
1、细胞内参与DNA复制的各种组成成分及反应条件。
 
参与的组分
 
在DNA复制中的作用
 
解旋酶
 
打开DNA双链
 
DNA母链
 
提供DNA复制的模板
 
4种脱氧核苷酸
 
合成子链的原料
 
DNA聚合酶
 
催化合成DNA子链
 
引物
 
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
 
2、DNA的合成方向
通常将DNA的羟基（—OH）末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，所以DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

3、DNA变性与复性
在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为DNA变性。
当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合的过程称为DNA复性。
4、TaqDNA聚合酶的应用
高温虽然解决了如何打开DNA双链的问题，但是，又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用，解决了上述矛盾，促成了PCR技术的自动化。
小结：
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
（二）PCR的反应过程
PCR一般要经过三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
延伸：复性后，当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
（三）PCR的基本操作
1、扩增对象的培养；
2、裂解细胞，释放出DNA；
3、设定PCR程序并进行扩增；
4、PCR产物的检测。
（四）凝胶色谱法
凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种方法。

a、相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。
b、（1）蛋白质混合物上柱；（2）洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；（3）相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动，（4）相对分子质量不同的分子完全分开；（5）相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
（五）缓冲溶液
缓冲溶液的缓冲作用表现为：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液。
（六）电泳
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
电泳利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
常用的分离方法有：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
常用测定蛋白质分子量的方法是：十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（七）血红蛋白的提取和分离
1、样品处理
 
（1）红细胞的洗涤；
（2）血红蛋白的释放；
（3）血红蛋白溶液的离心分离。
 
2、粗分离——透析除杂
 
经过透析去除相对分子质量较小的杂质。
 
3、样品的纯化
 
通过凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质蛋白。
 

4、纯度鉴定
 
经过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
 
思考：
1、凝胶的装填为什么要紧密、均匀？
凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流，出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
2、选择红细胞中的血红蛋白作实验材料有何意义？
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
课外拓展
PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管而Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。